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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

小鼠骨髓樹突狀分離自骨髓；骨髓是機體的造血組織，位于身體的許多骨骼內(nèi)。成年動物的骨髓分兩種：紅骨髓和黃骨髓。紅骨髓能制造紅細胞、血小板和各種白細胞。血小板有止血作用，白細胞能殺滅與抑制各種病原體，包括細菌、病毒等；某些淋巴細胞能制造抗體。因此，骨髓不但是造血器官，它還是重要的免疫器官。骨髓是存在于長骨(如肱骨、股骨)的骨髓腔和扁平骨(如髂骨)的稀松骨質(zhì)間的網(wǎng)眼中，是一種海綿狀的組織，能產(chǎn)生血細胞的骨髓略呈紅色，稱為紅骨髓。出生時，紅骨髓充滿全身骨髓腔，隨著年齡增大，脂肪細胞增多，相當(dāng)部分紅骨髓被黃骨髓取代，后幾乎只有扁平骨骨髓腔中有紅骨髓。骨髓DC細胞是由骨髓單核細胞誘導(dǎo)而成的；樹突狀細胞分為成熟樹突狀細胞和未成熟樹突狀細胞，典型的未成熟樹突狀細胞呈半貼壁生長，在GM-CSF、IL4的作用下形成葡萄串樣集落，細胞大而形態(tài)不規(guī)則，表面皺褶多，亦可見少量短刺狀突，胞內(nèi)細胞器豐富并可見吞噬泡，具有較強的遷移能力，伴隨有部分未誘導(dǎo)成的單核細胞，貼壁形態(tài)多樣。而成熟的樹突狀細胞由未成熟DC進一步經(jīng)TNFα、LPS等誘導(dǎo)而成，多數(shù)呈懸浮生長， 細胞呈圓形，細胞體積進一步增大，表面大量粗細不等的樹枝樣突起(高倍鏡或者電鏡下可觀察到 )，伴隨少量貼壁未成熟細胞或者單核細胞。未成熟DC細胞長時間培養(yǎng)也可能導(dǎo)致自發(fā)分化成熟。DC細胞尚無特異性細胞表面分子標志，主要通過形態(tài)學(xué)、組合性細胞表面標志、在混合淋巴細胞反應(yīng)中能激活初始T細胞等特征進行鑒定。其中成熟樹突狀細胞表面高表達主要組織相容性復(fù)合物(MHC)以及CD80、CD86等共刺激分子，進而激活T淋巴細胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)；未成熟樹突狀細胞具有很強的抗原攝取加工能力，但由于缺乏多種共刺激分子不能使初始T細胞活化、增殖產(chǎn)生免疫應(yīng)答，不能激活T細胞的信號，可導(dǎo)致T細胞無能，從而誘導(dǎo)免疫低反應(yīng)或抗原免疫特異性耐受。未成熟樹突狀細胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ類分子等共刺激分子表達較低，一般在30%以下。

方法簡介：

實驗室分離的小鼠骨髓成熟DC采用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞、培養(yǎng)過程添加細胞因子誘導(dǎo)而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的小鼠骨髓樹突狀(成熟DC細胞)經(jīng)CD86免疫熒光鑒定、細 胞 形態(tài)等綜合鑒定，純度可達80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：半貼壁半懸浮

細胞形態(tài)：圓形，樹突狀

傳代特性：屬于高度分化細胞；屬于不增殖細胞群

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

小鼠骨髓樹突狀(成熟DC細胞)體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠中性粒細胞明膠酶關(guān)聯(lián)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)檢測試劑盒 ，英文名： NGAL ELISA Kit

Mouse soluble cell differeiation aigen 40 Ligand (sCD40L) ELISA Kit 小鼠可溶性白細胞分化抗原40配體(sCD40L)檢測試劑盒

MouseFactor-relatedApoptosisligand,FASLELISAKit 小鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforHumanHypotheticalproteinLOC677168ELISAKit人假定蛋白LOC677168

B12比色法定量檢測試劑盒20次

ELISAKitHpt/HP大鼠結(jié)合珠蛋白/觸珠蛋白

PTPRC重組小鼠 CD45 / PTPRC 蛋白 (aa 453-1152, His & GST 標簽) Protein

鈣結(jié)合蛋白(CR)重組蛋白 Recombinant Calretinin (CR)

CRIPT重組人 CRIPT / cysteine-rich PDZ-binding 蛋白 Protein

CSNK1A1 Protein Human 重組人 CSNK1A1 / CKI-alpha / CK1 蛋白 (GST 標簽)

IL13 Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 IL13 / ALRH 蛋白

UL16結(jié)合蛋白2(ULBP2)重組蛋白 Recombinant UL16 Binding Brotein 2 (ULBP2)

CSNK1A1 Protein Human 重組人 CSNK1A1 / CKI-alpha / CK1 蛋白 (GST 標簽)

CD84重組小鼠 CD84 蛋白 Protein

EPCAM Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 / 恒河猴 EpCAM / TROP-1 / TACSTD1 蛋白 (Fc 標簽)

EPHA3重組人 EphA3 蛋白 Protein

小鼠Ⅷ相關(guān)抗原(FⅧ-Ag)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human coagulation factor IX (F IX) ELISA Kit 人Ⅸ(FⅨ)檢測試劑盒

Humanlowmolecular-weightprotein/proteasomebeta-typesubunit,LMP7/PSMB9ELISAKit 人低分子質(zhì)量蛋白7/β型蛋白酶體9(LMP7/PSMB9)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

Human17-Hydroxyprogesterone,17-OHP檢測試劑盒人17羥孕同(17-OHP)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

真菌/酵母細胞線粒體損傷/氧化(NAO)熒光測定試劑盒20/200次

MouseAquaporin0,AQP-0ELISAKit小鼠水通道蛋白0(AQP-0)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

小鼠骨髓樹突狀細胞(成熟DC細胞)小鼠可溶性壞死因子-α受體   英文名稱：   soluble tumor necrosis factor receptor 1   規(guī)格：      英文縮寫：   Stnf-αR

小鼠組織多肽抗原   英文名稱：   Tissue Polypeptide Aigen   規(guī)格：      英文縮寫：   TPA

小鼠血小板生成素   英文名稱：   Thromboietin   規(guī)格：      英文縮寫：   TPO

小鼠壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體   英文名稱：   tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand   規(guī)格：      英文縮寫：   AIL/APO 2L