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實(shí)驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡介：

兔嗅鞘分離自嗅球組織；嗅鞘細(xì)胞（OECs）是在功能上介于施旺細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間的一種特殊的膠質(zhì)細(xì)胞，具有神經(jīng)營養(yǎng)、抑制膠質(zhì)增生、瘢痕形成、成鞘作用等；為軸突生長提供了適宜的微環(huán)境及較強(qiáng)的遷移的特性，使其成為促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的理想候選細(xì)胞之一。嗅鞘細(xì)胞是目前所發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以再生細(xì)胞之一，其特點(diǎn)為終身具有神經(jīng)再生功能，還能夠釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)粘附分子。被認(rèn)為是髓鞘化能力強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞，逐漸用于治療脊髓損傷。嗅鞘細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞在表現(xiàn)型上有共同點(diǎn)，它們都能促進(jìn)軸突的再生，主要區(qū)別在于嗅鞘細(xì)胞不但存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于外周神經(jīng)中。嗅鞘細(xì)胞被認(rèn)為是一種可塑性很高的細(xì)胞，它可表現(xiàn)出多種細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志，在嗅系統(tǒng)發(fā)育過程中，嗅鞘細(xì)胞根據(jù)其在組織定位的不同而有不同的抗原表型，其中P75NTR、GFAP、和O4可標(biāo)記大部分在體嗅鞘細(xì)胞，然而在嗅球外神經(jīng)層O4陽性嗅鞘細(xì)胞仍然可以在P75NTR陽性細(xì)胞層內(nèi)分化成E-NCAM陽性的細(xì)胞層，還有一定比率的嗅鞘細(xì)胞P75NTR陰性而NY和S100表型為陽性。嗅黏膜中的神經(jīng)元是生后才生長并在成年時繼續(xù)分化的神經(jīng)元，壽命為4-12周，隨著新細(xì)胞的生長，又建立了新的神經(jīng)支配關(guān)系。嗅鞘細(xì)胞存在于嗅神經(jīng)及嗅球的神經(jīng)層上，沿嗅神經(jīng)的全長，從周圍神經(jīng)系統(tǒng)到中樞神經(jīng)分布。

方法簡介：

實(shí)驗室分離的兔嗅鞘采用-膠原酶聯(lián)合消化法、結(jié)合差速貼壁法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實(shí)驗室分離的兔嗅鞘經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：神經(jīng)元、上皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳1代，不建議傳代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔嗅鞘體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑?，個別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)檢測試劑盒 ，英文名： MMP9 ELISA Kit

Mouse ansforming growth factor beta 1 (TGF- beta 1) ELISA Kit 小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)檢測試劑盒

Ratα-glathioneS-ansferases,α-GSTELISAKit 大鼠αS轉(zhuǎn)移酶(α-GST)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

CLIAKitforFAS/CD95ELISAKit大鼠凋亡相關(guān)因子

細(xì)胞甲戊二羥酸激酶(mevalonatekinase)活性比色法定量檢測試劑盒20次

RatN-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGELISAKit大鼠N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

NA重組甲型流感 H3N2 神經(jīng)酶 (Neuraminidase / NA) (E119V mutation) (高活性) Protein

PSCA 前列腺干細(xì)胞抗原 0.5mgPSCA 前列腺干細(xì)胞抗原

NOG重組人 Noggin / NOG 蛋白 Protein

COASY Protein Human 重組人 COASY / CoA synthase 蛋白

EPHB6 Protein Human 重組人 EphB6 / EphB6 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)

PSCA 前列腺干細(xì)胞抗原 0.5mgPSCA 前列腺干細(xì)胞抗原

COASY Protein Human 重組人 COASY / CoA synthase 蛋白

NA重組甲型流感 H3N2 神經(jīng)酶 (Neuraminidase / NA) (E119V mutation) (高活性) Protein

EPHB6 Protein Human 重組人 EphB6 / EphB6 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)

NOG重組人 Noggin / NOG 蛋白 Protein

小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子3(-3)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human immunoglobulin heavy chain (IgH) ELISA Kit 重鏈(IgH)檢測試劑盒

HumanPulmonarysurfatca-associatedproteinA,SP-AELISAKit 人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(SP-A)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

Fishi-iodothyronine,T3檢測試劑盒魚類三甲狀腺原(T3)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

真菌/酵母非蛋白/游離巰基含量比色法定量檢測試劑盒20次

MouseCompleme1inhibitoraoaibody,C1INHELISAKit小鼠補(bǔ)體1抑制物抗體(C1INH)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

兔嗅鞘細(xì)胞小鼠趨化因子(mouse RAES)   作用：   ELISA   規(guī)格：      進(jìn)口分裝

小鼠抵抗素(mouse Resistin)   作用：   ELISA   規(guī)格：      進(jìn)口分裝

小鼠可溶性破骨細(xì)胞異化因子(mouse sRANKL)   作用：   ELISA   規(guī)格：      進(jìn)口分裝

小鼠血清淀粉樣蛋白(mouse SAA)   作用：   ELISA   規(guī)格：      進(jìn)口分裝