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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

人骨髓樹突狀分離自骨髓；骨髓是機體的造血組織，位于身體的許多骨骼內(nèi)。成年動物的骨髓分兩種：紅骨髓和黃骨髓。紅骨髓能制造紅細胞、血小板和各種白細胞。血小板有止血作用，白細胞能殺滅與抑制各種病原體，包括細菌、病毒等；某些淋巴細胞能制造抗體。因此，骨髓不但是造血器官，它還是重要的免疫器官。骨髓是存在于長骨(如肱骨、股骨)的骨髓腔和扁平骨(如髂骨)的稀松骨質(zhì)間的網(wǎng)眼中，是一種海綿狀的組織，能產(chǎn)生血細胞的骨髓略呈紅色，稱為紅骨髓。出生時，紅骨髓充滿全身骨髓腔，隨著年齡增大，脂肪細胞增多，相當(dāng)部分紅骨髓被黃骨髓取代，后幾乎只有扁平骨骨髓腔中有紅骨髓。骨髓DC細胞是由骨髓單核細胞誘導(dǎo)而成的；樹突狀細胞分為成熟樹突狀細胞和未成熟樹突狀細胞，典型的未成熟樹突狀細胞呈半貼壁生長，在GM-CSF、IL4的作用下形成葡萄串樣集落，細胞大而形態(tài)不規(guī)則，表面皺褶多，亦可見少量短刺狀突，胞內(nèi)細胞器豐富并可見吞噬泡，具有較強的遷移能力，伴隨有部分未誘導(dǎo)成的單核細胞，貼壁形態(tài)多樣。而成熟的樹突狀細胞由未成熟DC進一步經(jīng)TNFα、LPS等誘導(dǎo)而成，多數(shù)呈懸浮生長， 細胞呈圓形，細胞體積進一步增大，表面大量粗細不等的樹枝樣突起(高倍鏡或者電鏡下可觀察到 )，伴隨少量貼壁未成熟細胞或者單核細胞。未成熟DC細胞長時間培養(yǎng)也可能導(dǎo)致自發(fā)分化成熟。DC細胞尚無特異性細胞表面分子標(biāo)志，主要通過形態(tài)學(xué)、組合性細胞表面標(biāo)志、在混合淋巴細胞反應(yīng)中能激活初始T細胞等特征進行鑒定。其中成熟樹突狀細胞表面高表達主要組織相容性復(fù)合物(MHC)以及CD80、CD86等共刺激分子，進而激活T淋巴細胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)；未成熟樹突狀細胞具有很強的抗原攝取加工能力，但由于缺乏多種共刺激分子不能使初始T細胞活化、增殖產(chǎn)生免疫應(yīng)答，不能激活T細胞的信號，可導(dǎo)致T細胞無能，從而誘導(dǎo)免疫低反應(yīng)或抗原免疫特異性耐受。未成熟樹突狀細胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ類分子等共刺激分子表達較低，一般在30%以下。

方法簡介：

實驗室分離的人骨髓成熟DC采用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞、培養(yǎng)過程添加細胞因子誘導(dǎo)而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的人骨髓樹突狀(成熟DC細胞)經(jīng)CD86免疫熒光鑒定、細 胞 形態(tài)等綜合鑒定，純度可達80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：半貼壁半懸浮

細胞形態(tài)：圓形，樹突狀

傳代特性：屬于高度分化細胞；屬于不增殖細胞群

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

人骨髓樹突狀(成熟DC細胞)體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

小鼠酸激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISA 試劑盒

One set of membrane protein (iNV) ELISA Kit 人套膜蛋白(iNV)檢測試劑盒

Humanglycogensyhasekinase,GSKELISAKit 人糖原合成酶激酶(GSK)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

Humanbonesialoprotein,BSP檢測試劑盒人骨涎蛋白(BSP)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

植物組織胞漿超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)分離試劑盒50次

HumanStaphylococalproteinA,SPAELISAKit人葡萄球菌蛋白A(SPA)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

NA重組甲型流感 H7N9 (A/Shanghai/1/2013) 神經(jīng)酶 (Neuraminidase / NA) Protein

phospho-JNK1/2/3(pThr183/pTyr185 0.2mlphospho-JNK1/2/3(pThr183/pTyr185) peptide 0酸化氨基末端激酶1/2/3(pJNK1/2/3)抗原

EGFR重組人 EGFR / HER1 / ErbB1 蛋白 Protein

CEP57 Protein Human 重組人 CEP57 / MVA2 蛋白 (GST 標(biāo)簽)

PF4 Protein Human 重組人 CXCL4 / PF4 蛋白

phospho-JNK1/2/3(pThr183/pTyr185 0.2mlphospho-JNK1/2/3(pThr183/pTyr185) peptide 0酸化氨基末端激酶1/2/3(pJNK1/2/3)抗原

CEP57 Protein Human 重組人 CEP57 / MVA2 蛋白 (GST 標(biāo)簽)

NA重組甲型流感 H7N9 (A/Shanghai/1/2013) 神經(jīng)酶 (Neuraminidase / NA) Protein

PF4 Protein Human 重組人 CXCL4 / PF4 蛋白

EGFR重組人 EGFR / HER1 / ErbB1 蛋白 Protein

小鼠脫氫表雄酮S7(DHEA-S7)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPAR- alpha) ELISA Kit 大鼠過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)檢測試劑盒

Humanserine/threonineproteinkinase,STKELISAKit 人絲/蘇蛋酸酶(STK)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

ChickenParathyroidhormone,PTH檢測試劑盒雞甲狀旁腺激素(PTH)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

載玻片細胞PAR-1蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次

MouseFolicacid,FAELISAKit小鼠(FA)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

人骨髓樹突狀細胞(成熟DC細胞)小鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠脫氧酚/脫氧啉(DPD)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠脫氫表雄酯(DHEA-S)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠脫氫表雄S7(DHEA-S7)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝