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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

大鼠心臟干分離自心臟組織；心臟是脊椎動物身體中重要的一個器官，主要功能是為血液流動提供壓力，把血液運行至身體各個部分。心臟由心肌構(gòu)成，左心房、左心室、右心房、右心室四個腔組成。左右心房之間和左右心室之間均由間隔隔開，故互不相通，心房與心室之間有瓣膜（房室瓣），這些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。心臟的作用是推動血液流動，向器官、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營養(yǎng)物質(zhì)，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳、無機鹽、尿素和尿酸等），使細胞維持正常的代謝和功能。研究發(fā)現(xiàn)，心臟干細胞是一種多潛能細胞，具有再生和克隆能力，并可分化為心肌細胞、平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞。體內(nèi)研究顯示，從心臟中分離出的心臟干細胞，經(jīng)體外簡單培養(yǎng)、增殖和標記后，移植到心肌梗死邊緣區(qū)域，心梗血流動力學和心室壁厚度較對照組明顯改善，心肌梗死邊緣區(qū)域發(fā)現(xiàn)有標記的心肌細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞。盡管其新生心肌細胞較小，但表達一些特殊肌蛋白如心臟肌球蛋白重鏈、α-肌動蛋白、α-輔肌動蛋白、連接蛋白等，證實了心臟干細胞對心肌梗死的修復(fù)作用。干細胞移植治療是目前心肌梗死和缺血性心臟病細胞重建的主要方法，成體干細胞中的c-kit陽性心臟干細胞因其來源于心臟，有定向心臟細胞系分化的趨勢，體內(nèi)外可以分化成心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，同時自體移植不存在免疫排斥反應(yīng)及倫理問題已經(jīng)成為目前研究的熱點。短期內(nèi)獲得治療量的自體心臟干細胞是這一治療應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵所在。因此，研究一種新的分離培養(yǎng)方法可在短時期內(nèi)獲得大量純度較高的自體c-kit陽性心臟干細胞成為目前干細胞領(lǐng)域研究的熱點問題之一。

方法簡介：

公司實驗室分離的大鼠心臟干采用機械剪碎組織、膠原酶分次消化法結(jié)合差速貼壁、心臟干細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的大鼠心臟干經(jīng)c-kit免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 長梭形

傳代特性 可傳3代左右

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠線粒體解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)檢測試劑盒 ，英文名： UCP1 ELISA Kit

Pla vitamin E (VE) ELISA Kit 植物(VE)檢測試劑盒

MouseImmunoglobulinE,IgEELISAKit 小鼠免疫球蛋白E(IgE)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforHumanalpha-granularmembraneprotein,GMP-140ELISAKit人血漿α顆粒膜蛋白

細胞HHV6(HUMANHERPESVIRUS6)病毒定性檢測試劑盒20次

ELISAKitSOD大鼠超氧化物歧化酶

PDCD1重組人 PD1 / PDCD1 蛋白 Protein

尾加壓素2(UST2)重組蛋白 Recombinant Urotensin 2 (UST2)

RAET1E重組人 RAET1E / ULBP4 蛋白 (Fc 標簽) Protein

CD55 Protein Human 重組人 CD55 / DAF 蛋白

HA Protein H1N3 重組甲型流感 H1N3 (A/duck/NZL/160/1976) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白

尾加壓素2(UST2)重組蛋白 Recombinant Urotensin 2 (UST2)

CD55 Protein Human 重組人 CD55 / DAF 蛋白

PDCD1重組人 PD1 / PDCD1 蛋白 Protein

HA Protein H1N3 重組甲型流感 H1N3 (A/duck/NZL/160/1976) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白

RAET1E重組人 RAET1E / ULBP4 蛋白 (Fc 標簽) Protein

小鼠血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)檢測試劑盒 96T/48T

Rat calcium binding protein (CR) ELISA Kit 大鼠鈣結(jié)合蛋白(CR)檢測試劑盒

Humanai-myelinaibodyIgAELISAKit 人抗髓0脂抗體IgA(ai-myelinAb)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CamelBeta-Endorphin,β-EP檢測試劑盒β內(nèi)啡肽(β-EP)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

魚類組織元素熒光定量檢測試劑盒20次

Mouseinsulinaoaibodies,IAAELISAKit小鼠胰島素自身抗體(IAA)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

大鼠心臟干細胞小鼠血小板衍生生長因子可溶性受體檢測試劑盒   小鼠血小板衍生生長因子可溶性受體試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   小鼠血小板衍生生長因子可溶性受體試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：檢測試劑盒（進口分裝），產(chǎn)品別名：小鼠血小板衍生生長因子可溶性受體試劑盒、小鼠血小板衍生生長因子可溶性受體檢測試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

小鼠胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白檢測試劑盒   小鼠胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   小鼠胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：檢測試劑盒（進口分裝），產(chǎn)品別名：小鼠胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白試劑盒、小鼠胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白檢測試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

小鼠血小板衍生生長因子檢測試劑盒   小鼠血小板衍生生長因子試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   小鼠血小板衍生生長因子試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：檢測試劑盒（進口分裝），產(chǎn)品別名：小鼠血小板衍生生長因子試劑盒、小鼠血小板衍生生長因子檢測試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

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